潔凈度（沉降菌）的檢驗標準操作規(guī)程

1 目的

   建立潔凈度（沉降菌）的檢驗標準操作規(guī)程，為沉降菌檢查人員提供正確的標準操作方法。

2 范圍

適用于本公司潔凈度（沉降菌）檢查的全過程。

3 責任

QA對本規(guī)程的有效執(zhí)行承擔監(jiān)督檢查責任，QC對本規(guī)程的實施負責。

4 程序

4.1概述：本標準對塵粒及微生物污染規(guī)定需進行環(huán)境控制的房間或區(qū)域。其建筑結構、裝備及其使用均具有減少對該區(qū)域內污染源的介入、產生和滯留的功能。

4.2測試方法

4.2.1方法提要：

     本標準按國家技術監(jiān)督局發(fā)布的《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》，采用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數(shù)，以平板培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)來判定潔凈環(huán)境內的活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈室（區(qū)）的潔凈度。

4.2.2儀器

     儀器包括：培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器。

4.2.2.1培養(yǎng)皿

       一般采用f90mm×15mm規(guī)格的培養(yǎng)皿。

4.2.2.2培養(yǎng)基

       大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）或沙氏培養(yǎng)基（SDA）或用戶認可并經驗證了的培養(yǎng)基。

4.3測試前的規(guī)則：

4.3.1測試狀態(tài)；

4.3.1.1沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在規(guī)定值內。潔凈室（區(qū)）的溫度和相對濕度應與其生產及工藝要求相適應（無特殊要求時，溫度在18℃～26℃，相對濕度在45%～65%之間為宜），同時應滿足測試儀器的使用范圍。

4.3.1.2沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）已經過消毒。

4.3.1.3測試狀態(tài)有靜態(tài)和動態(tài)兩種，測試狀態(tài)的選擇必須符合生產的要求，并在報告中注明測試狀態(tài)。

4.3.1.4靜態(tài)測試時，培養(yǎng)皿暴露時間為30min以上；動態(tài)測試時，培養(yǎng)皿暴露時間為不大于4h。

4.3.2測試人員：

4.3.2.1測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別的工作服。

4.3.2.2靜態(tài)測試時，室內測試人員不得多于2人。

4.3.3測試時間：

4.3.3.1對單向流，如100級凈化房間及層流工作臺，測試應在凈化空調系統(tǒng)正

常運行不少于10min后開始。

4.3.3.2對非單向流，如B級、B級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統(tǒng)正常運行不少于30min后開始。

4.3.4注意事項：

4.3.4.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。

4.3.4.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。

4.3.4.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細的記錄。

4.3.4.4由于細菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。

4.3.4.5采樣前應仔細檢查每個培養(yǎng)皿的質量，如發(fā)現(xiàn)變質、破損或污染的應剔除。

4.3.4.6對于單向流潔凈室（區(qū)）或送風口，采樣器采樣口朝向應正對氣流方向；對于非單向流（區(qū)），采樣口向上。

4.3.4.7布置采樣點時，至少應盡量避開塵粒較集中的回風口；采樣時，測試人員應站在采樣口的下風側，并盡量少走動。

4.3.4.8培養(yǎng)皿在用于檢測時，為避免培養(yǎng)皿運輸或搬動過程造成的影響，宜同時進行對照試驗，每次或每個區(qū)域取1個對照皿，與采樣皿同法操作但不需暴露采樣，然后與采樣后的培養(yǎng)皿（TSA或SDA）一起放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，結果應無菌落生長。

4.4測試步驟：

4.4.1采樣方法：

4.4.1.1儀器和用具：培養(yǎng)皿。

4.4.1.2方法：

a采樣點一般在離地面0.8m高度的水平面上均勻布置。

b采樣點多于5點時，也可以在離地面0.8m～1.5m高度的區(qū)域內分層布置，但每層不少于5點。

c打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。

                            最少采樣點數(shù)目

最少培養(yǎng)皿數(shù)

4.4.2培養(yǎng)：

4.4.2.1儀器和用具：培養(yǎng)箱、天平（萬分之一）、稱量紙、錐形瓶（1000ml、150ml）、量筒（1000ml）、高壓蒸汽滅菌鍋。

4.4.2.2培養(yǎng)基：

4.4.2.2.1大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：

a） 成分：酪蛋白胰酶消化物 15g    大豆粉木瓜蛋白酶消化物  5g    氯化鈉  5g    瓊脂  15g    純化水   1000ml

b） 制法：取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無菌操作要求下傾注約20ml至無菌平皿（f90mm）中。加蓋后在室溫放至凝固。

4.4.2.2.2沙氏培養(yǎng)基（SDA）：

     a）葡萄糖   40g    酪蛋白胰酶消化物、動物組織的胃酶消化物等量混合  10g     瓊脂  15g      純化水   1000ml

b）制法：取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節(jié)pH值使滅菌后為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無菌操作要求下傾注約20ml至無菌平皿（f90mm）中。加蓋后在室溫放至凝固。

4.4.2.3方法：全部采樣結束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配制的培養(yǎng)皿在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于2天；采用沙氏培養(yǎng)基（SDA）配制的培養(yǎng)皿在20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于5天。每批培養(yǎng)基應有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染。可每批選定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。

4.4.3菌落計數(shù)：

4.4.3.1用肉眼直接計數(shù)，標記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

4.4.3.2若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。

4.4.4結果計算：

4.4.4.1用計數(shù)方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。

4.4.4.2平均菌落數(shù)的計算，見式。

                             M1+M2+…+Mn   

平均菌落數(shù)M=   

                                 n

式中 M—平均菌落數(shù)；

               M1—1號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；

               M2—2號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；

               Mn—n號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；

               n—培養(yǎng)皿總數(shù)。

4.4.5結果評定：

     用平均菌落數(shù)判斷潔凈室（區(qū)）空氣中的微生物。

4.4.5.1潔凈室（區(qū)）內的平均菌落數(shù)必須低于所選定的評定標準。

4.4.5.2在靜態(tài)測試時，若某潔凈室（區(qū)）內的沉降菌平均菌落數(shù)超過評定標準，則必須對此區(qū)域先進行消毒，然后重新采樣兩次，測試結果均須合格。